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Tipo do documento: Dissertação
Título: EFEITO DO EXTRATO DE Dysphania ambrosioides (L) NA RESPOSTA DE NEUTRÓFILOS HUMANOS.
Título(s) alternativo(s): EFFECT OF EXTRACT of Dysphania ambrosioides (L) ON RESPONSE OF HUMAN NEUTROPHILS.
Autor: GOMES, Lillian Nunes 
Primeiro orientador: PEREIRA, Paulo Vitor Soeiro
Primeiro membro da banca: PEREIRA, Paulo Vitor Soeiro
Segundo membro da banca: PERAZZIO, Sandro Félix
Terceiro membro da banca: NASCIMENTO, Flavia Raquel Fernandes do
Quarto membro da banca: SOUSA, Ana Paula Silva de Azevedo
Resumo: Os neutrófilos dispõem de mecanismos rápidos de resposta imune a patógenos como a fagocitose e a liberação de potentes mediadores inflamatórios pré-formados ou não. No entanto, a ativação exacerbada dessas células está relacionada com a piora de algumas doenças inflamatórias e com os efeitos danosos nas infecções crônicas. A busca de novas fontes de moléculas que auxiliem na regulação desses mecanismos faz-se necessária. Nesse contexto, os produtos naturais são uma possibilidade interessante, e a espécie vegetal Dysphania ambrosioides (mastruz) apresenta diferentes atividades biológicas demonstradas em modelos experimentais. Neste trabalho, foi avaliado o efeito in vitro do extrato bruto hidroalcoólico de Dysphania ambrosioides (EHDa) em neutrófilos humanos. Para tal, neutrófilos do sangue periférico de doadores saudáveis foram tratados com EHDa nas concentrações de 5, 50 ou 125 µg/mL. Para o ensaio de fagocitose as células foram tratadas por uma ou quatro horas e incubadas com leveduras de Candida albicans-GFP (Green Fluorescente Protein) na proporção de 1:2 (célula: levedura), por 30 minutos, e analisada por citometria de fluxo. O EHDa não interferiu na atividade fagocítica dos neutrófilos, independente das concentrações e tempo de tratamento. Para avaliação da degranulação, os neutrófilos foram tratados por uma ou duas horas e marcados com anticorpos Anti-CD63 (grânulos primários), Anti-CD66b e Anti-CD15 (grânulos secundários) e Anti-CD14 (vesícula secretora). O EHDa estimulou a migração da vesícula secretora e grânulos secundários de maneira dose dependente, nos dois tempos avaliados. Já para os grânulos primários, no tempo de uma hora, apenas a maior concentração (125 µg/mL) induziu a exocitose desses, e em duas horas, esse efeito foi observado nas duas maiores concentrações (50 e 125 µg/mL). Quanto ao burst oxidativo, os neutrófilos tratados com EHDa por uma ou quatro horas, foram posteriormente estimulados ou não com acetato miristado de forbol (PMA); a produção dos reativos foi quantificada via quimioluminescência dependente de luminol e lucigenina. Como resultado, o tratamento induziu o burst oxidativo de forma semelhante nos dois tempos. E quando os neutrófilos receberam o estímulo posterior com PMA, nos grupos tratados com o extrato houve uma redução na produção desse reativos, e na maior concentração (125 µg/mL) essa redução foi mais expressiva. Já a liberação das NETs (Neutrophils Extracellular Traps) foi avaliada de forma quantitativa (emissão de fluorescência pelo método de Sytox® Orange) e qualitativa (por microscopia de fluorescência). O tratamento mostrou uma tendência de estimular NETs, porém, não foi significativo. E quando os neutrófilos foram tratados com EHDa e estimulados com PMA, o tratamento mostrou potencial de regular esse mecanismo de neutrófilos, semelhante ao resultado do burst oxidativo. O tratamento com o extrato hidroalcóolico de Dysphania ambrosioides estimulou os principais mecanismos efetores de neutrófilos humanos, sem manter essa ativação em níveis potencialmente deletérios para o organismo, além de modular a resposta num contexto de “super-ativação” na presença do PMA. Esses resultados reforçam a perspectiva de uso do mastruz como terapia, podendo ser aplicado em patologias infecciosas e/ou inflamatórias.
Abstract: Neutrophils present rapid mechanisms of immune response against pathogens phagocytosis, as and release of potent preformed or not inflammatory mediators. However, exacerbated activation of these cells has been related to worsening of some inflammatory diseases and harmful effects in chronic infections. In this context, regulation of these mechanisms is necessary. Natural products are an interesting possibility, and the plant Dysphania ambrosioides (mastruz) already has several biological activities demonstrated, for example immunomodulation. In this work, we evaluated in vitro effect of crude hydroalcoholic extract of Dysphania ambrosioides (HEDa) on human neutrophils. Peripheral blood neutrophils from healthy donors were treated with HEDa at 5, 50 or 125 μg / mL for one, two or four hours. After treatment by one or four, cells were incubated with Candida albicans-GFP (Green Flourescent Protein) yeasts at a ratio of 1: 2 (cells: yeast) for 30 minutes, and phagocytosis was analyzed by flow cytometry. The HEDa did not interfere in phagocytic activity of neutrophils, regardless of the concentrations and time of treatment. For degranulation assay, neutrophils were treated for one to two hours and labeled with Anti-CD63 (primary granules), Anti-CD66b and Anti-CD15 (secondary granules) and Anti-CD14 (secretory vesicle) antibodies. HEDa stimulated migration of secretory vesicle and secondary granules in a dose dependent manner, in both evaluated times. However, in the one-hour period, only the highest concentration (125 μg / mL) induced exocytosis, and in two hours, this effect was observed in 50 and 125 μg / mL. For oxidative burst, neutrophils treated with HEDa were subsequently stimulated or not with phorbol-12- myristate-13-acetate (PMA); production of reactive oxygen species (ROS) was quantified by luminol-dependent chemiluminescence and lucigenina assay. As a result, the treatment stimulated oxidative burst in a similar way in both times. When neutrophils received a posterior stimulus with PMA, cells treated with HEDa had a reduction in ROS generation, and at 125 μg / mL this reduction was more expressive. Neutrophil Extracellular Traps (NETs) release was evaluated quantitatively (Sytox® Orange fluorescence assay) and qualitative (fluorescence microscopy). HEDa treatment showed a tendency to stimulate NETs, however, it was not significant. When neutrophils were treated with EHDa and stimulated by PMA, the treatment showed potential to regulate this mechanism, similar to oxidative burst results. Treatment with hydroalcoholic extract of D. ambrosioides stimulated the main effector mechanisms of human neutrophils without maintaining this activation at potential deleterious levels to the organism, and presented a modulatory effect in a PMA over-stimulated cells. These results reinforce the perspective of use of mastruz as a therapy, applied in infectious and / or inflammatory diseases.
Palavras-chave: Neutrófilos; mastruz; inflamação; burst oxidativo; degranulação
Neutrophils; mastruz; inflammation; oxidative burst; degranulation
Área(s) do CNPq: Alergologia e Imunologia Clínica.
Idioma: por
País: Brasil
Instituição: Universidade Federal do Maranhão
Sigla da instituição: UFMA
Departamento: DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA/CCBS
Programa: PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE/CCBS
Citação: GOMES, Lillian Nunes. Efeito do extrato de Dysphania ambrosioides (L) na resposta de neutrófilos humanos.. 2018. 87 folhas. Dissertação( Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde/CCBS) - Universidade Federal do Maranhão, São Luís.
Tipo de acesso: Acesso Aberto
URI: https://tedebc.ufma.br/jspui/handle/tede/tede/2339
Data de defesa: 6-Jun-2018
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