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Tipo do documento: Tese
Título: Croton triqueter Lam.: efeito antitumoral e ativação da imunidade inata
Título(s) alternativo(s): Croton triqueter Lam.: antitumor effect and activation of innate immunity
Autor: SERRA, Izabel Cristina Portela Bogéa 
Primeiro orientador: NASCIMENTO, Flávia Raquel Fernandes do
Primeiro membro da banca: PEREIRA, Paulo Vitor Soeiro
Segundo membro da banca: COSTA JUNIOR, Livio Martins
Terceiro membro da banca: SILVA, Lucilene Amorim
Quarto membro da banca: NICOLETE, Roberto
Resumo: A busca por medicamentos antineoplásicos tem aumentado, com o objetivo de ampliar as possibilidades de tratamentos, de torná-los mais efetivos e seguros. Neste trabalho investigou-se o efeito antitumoral in vitro e in vivo do extrato etanólico das folhas de Croton triqueter Lam. (EEJ), assim como, possíveis mecanismos imunológicos envolvidos nesta resposta. Além disso, avaliou-se o efeito desse extrato sobre o sistema imunológico de camundongos sadios. Para avaliação da citotoxicidade foi utilizado o ensaio de MTT, na qual o EEJ apresentou em todas as concentrações testadas citotoxicidade para as células do carcinoma de Ehrlich. Por outro lado, apenas a maior concentração (500 µg/mL) reduziu 20,4% a viabilidade dos macrófagos RAW 264.7. Para avaliação da atividade antitumoral in vivo, camundongos Swiss, adultos (± 60 dias, 30 ± 5 g), machos foram inoculados por via intraperitoneal com células do tumor de Ehrlich (2x106 /animal) e tratados nos dias 3, 5, 7 e 9 após inóculo do tumor com o EEJ nas doses de 125, 250 e 500 mg/kg por via oral (v.o.). O grupo controle recebeu solução tamponada com fosfato (PBS), v.o. Além disso, foi utilizado um grupo controle sem tumor e tratados com o EEJ nas mesmas doses e esquema terapêutico. Metade dos animais foram eutanasiados 10 dias após inóculo do tumor, a outra metade foi mantida viva para acompanhamento da sobrevida e cálculo da expectativa de vida. O desenvolvimento tumoral foi avaliado pelo peso dos animais, circunferência abdominal, volume da ascite e número das células tumorais totais. O sangue total foi coletado para determinação de parâmetros hematológicos. Citocinas (IL-6, IL-10, TNF-α, IFN-, IL-12) e a quimiocina MCP-1 presentes na ascite e no soro foram dosadas pela técnica de CBA. Baço, medula e os linfonodos mesentéricos foram obtidos para realização da contagem das células linfoides. Após a contagem, uma parte da suspensão de células do baço foi submetida à cultura para avaliação da produção de NO e outra parte foi utilizada para realização de imunofenotipagem por citometria de fluxo para células T, NK, NKT e apresentadoras de antígenos. Os resultados obtidos demonstraram que o EEJ aumentou a expectativa de vida dos animais portadores de tumor, assim como reduziu o número de células tumorais totais presentes na cavidade peritoneal. Além disso, o EEJ, tanto nos animais inoculados com tumor quanto nos não inoculados, não alterou os parâmetros hematológicos analisados nem o número de células da medula óssea e do linfonodo mesentérico. Na contagem diferencial dos leucócitos, o EEJ foi capaz de aumentar o número de linfócitos e monócitos e reduzir o número de polimorfonucleares nos camundongos inoculados com tumor e tratados com o EEJ. Foi observado que nos animais inoculados ou não com tumor de Ehrlich, o EEJ na dose de 500 mg/kg promoveu um aumento do número de células do baço, sendo que nos animais inoculados com tumor houve um aumento da frequência absoluta de células T CD4+ e CD8+ , além do aumento dessas populações que expressavam o marcador CD28+ , bem como, aumento de células CD3-CD49b+NK1.1+ , CD3+CD49b+NK1.1+ e IA-IE+Ly6C-Ly6G+CD86+ . A dose de 125 mg/kg aumentou a frequência absoluta de células T CD4+ e CD8+ ativadas, enquanto que a dose de 250 mg/kg aumentou somente a população de células T CD8+ ativadas. Verificou-se ainda, que o tratamento com o EEJ nas três doses reduziu a concentração de IL-6 na ascite de forma dose dependente, aumentou a concentração de IFN- e apenas a dose de 500 mg/kg reduziu a concentração TNF-. No soro, a dose de 125 mg/kg reduziu a concentração de IL-6 e aumentou IFN-. Quanto a análise do EEJ sobre os macrófagos RAW 264.7 estimulados ou não com LPS foi possível verificar um aumento da expressão dos marcadores CD14+ , IA-IE e CD86+ nos macrófagos com e sem LPS, indicando que o EEJ apresenta a capacidade de polarizar macrófagos para o perfil M1. No ensaio de polarização de macrófagos, o EEJ foi capaz de aumentar a expressão dos marcadores IA-IE e CD86+ nos macrófagos previamente polarizados para os perfis M1 e M2. Estes resultados indicam que a espécie vegetal Croton triqueter Lam. exibe propriedade antitumoral, sugerindo que, além do efeito direto, mecanismos imunológicos estariam envolvidos nessa resposta.
Abstract: The search for anticancer drugs has increased, with the aim of expanding the possibilities of treatments, to make them more effective and safe. In this work it was investigated the antitumor effect in vitro and in vivo of an ethanolic extract of Croton triqueter Lam. (EEJ) leaves, as well as possible mechanisms involved in this response. In addition, it assessed the effect of this extract on the immune system of healthy mice. For cytotoxicity evaluation was used the MTT assay, where the EEJ presented at all concentrations tested, cytotoxicity to Ehrlich carcinoma cells. On the other hand, only the highest concentration (500 µg/mL) reduced 20.4% the viability of RAW 264.7 macrophages. For evaluation of antitumor activity in vivo, Swiss mice, adult (± 60 days, 30 ± 5 g), male were inoculated intraperitoneally with the Ehrlich tumor cells (2x106 /animal) and treated on days 3, 5, 7, and 9 after tumor inoculation with EEJ at doses of 125, 250 and 500 mg/kg orally (po). The control group received phosphatebuffered saline (PBS), po. Furthermore, it was used a non-tumor bearing control group and treated with the same doses of EEJ and therapeutic regimen. Half of the animals were euthanized 10 days after tumor inoculation, the other half was kept alive for monitoring survival and calculation of life expectancy. The tumor development was evaluated by animal weight, waist circumference, ascites volume and total number of tumor cells. Whole blood was collected for determination of haematological parameters. Cytokines (IL-6, IL-10, TNF-α, IFN-, IL-12) and the chemokine MCP-1 present in the ascites and serum were measured by CBA technique. Spleen, bone marrow and mesenteric lymph nodes were obtained to perform the counting of lymphoid cells. After counting a portion of the spleen cell suspension was subjected to culture for assessment of NO production and another part was used to perform immunophenotyping by flow cytometry for T cells, NK, NKT cells and antigenpresenting cells. The results showed that the EEJ increased the lifespan of tumorbearing animals, and reduced the total number of tumor cells present in the peritoneal cavity. Besides, the EEJ in animals inoculated with tumor and the uninoculated not altered hematological parameters or the number of cells in the bone marrow and mesenteric lymph nodes. In the leukocyte differential count, EEJ was able to increase the number of lymphocytes and monocytes and reduce the number of polymorphonuclear leukocytes in mice inoculated with tumor and treated with EEJ. It was observed that in animals inoculated with or without Ehrlich tumor, EEJ at the dose of 500 mg/kg provided an increased number of spleen cells, and in animals inoculated with tumor there was an increase in the absolute frequency of CD4+ and CD8+ T cells, besides the increase of these populations expressing CD28+ marker, as well as increase of CD3-CD49b+NK1.1+ and IA-IE+Ly6C-Ly6G+CD86+ cells. The dose of 125 mg/kg increased the absolute frequency of CD4+ and CD8+ T cells activated, whereas the dose of 250 mg/kg only increased the population of CD8+ T cells activated. It was also found that the treatment with EEJ at three doses reduced the IL-6 concentration in the ascites dose-dependent manner, increased the IFN- concentration and only dose of 500 mg/kg reduced the TNF-α concentration. In serum, the dose of 125 mg/kg reduced the IL-6 concentration and increased IFN-. The analysis of EEJ on RAW 264.7 macrophages stimulated or not with LPS was possible to verify increased expression of CD14+ , IA-IE and CD86+ markers on macrophages with and without LPS, indicating that the EEJ has the ability to polarize macrophages to the profile M1. On macrophages polarization assay, EEJ was able to increase expression of IA-IE+ and CD86+ markers on previously polarized macrophages to the profiles M1 and M2. These results indicate that plant species Croton triqueter Lam. exhibits antitumor property, suggesting that, in addition to direct effects, immunological mechanisms were involved in this response.
Palavras-chave: Câncer
Plantas medicinais
Tumor de Ehrlich
Microambiente tumoral
Macrófagos
Medicinal plants
Ehrlich tumor
Tumor microenvironment
Macrophages
Área(s) do CNPq: Cancerologia
Idioma: por
País: Brasil
Instituição: Universidade Federal do Maranhão
Sigla da instituição: UFMA
Departamento: DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA/CCBS
Programa: PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA - RENORBIO/CCBS
Citação: SERRA, Izabel Cristina Portela Bogéa. Croton triqueter Lam.: Efeito antitumoral e ativação da imunidade inata. 2016. 165. Tese (Doutorado em Biotecnologia) - Rede Nordeste de Biotecnologia, Universidade Federal do Maranhão, São Luís, 2016.
Tipo de acesso: Acesso Aberto
URI: https://tedebc.ufma.br/jspui/handle/tede/tede/2217
Data de defesa: 25-Jul-2016
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